### 培养条件

气相条件：95%空气 + 5%二氧化碳；温度维持在37℃。A549细胞系于1972年由GiardDJ通过肺癌组织移植建立，来源于一位58岁的白人男性。这一细胞系以其能够通过胞苷二磷脂酰胆碱途径合成富含不饱和脂肪酸的卵磷脂而著称，且角蛋白呈阳性。A549细胞系是一种经典的人类肺癌细胞系，来源于人类肺腺癌（Adenocarcinoma of the Lung）肿瘤组织。该细胞系由美国典型培养物保藏中心（ATCC）于1972年从一名58岁肺腺癌患者的胸腔积液中分离而成，目前广泛应用于肺癌研究、药物开发及分子机制探讨。

### 传代方法

初次传代建议采用1:2比例，传代间隔更新培养液可每隔2天进行一次。在收到细胞后，请在处理至良好状态后添加完全培养液并封好瓶口，这是运输细胞的最佳方式。收到细胞后，请勿立即打开瓶盖，务必确认培养瓶上标注的细胞名称与订单一致，并检查瓶口是否有破损或漏液。如未发现异常，应在显微镜下观察细胞生长情况，并进行不同倍数拍照留存（建议拍摄40x、100x、200x各一张），前三天的照片为售后服务的重要依据，未提供照片将默认细胞状态良好。

贴壁细胞的传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 加入约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，放置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞的消化情况。若细胞大部分变圆并开始脱落，应迅速将其带回操作台，轻敲培养瓶后加入5ml以上的完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使之全部脱落后吸出，并将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补充1-2ml完全培养基重悬。
4. 将重悬的细胞按1:2比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，后续放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

### 悬浮细胞的传代步骤

1. 采用半换液法：将培养瓶竖放于培养箱内静置约1小时，轻轻吸去约3ml培养基后，加3ml的完全培养基；如培养基变色较慢，可直接加入约500ul FBS进行补充。传代时可直接补给5ml培养基并分瓶培养，通常需进行3次半换液后再进行离心传代以去除死细胞。
2. 离心换液法：如需分瓶，可将细胞悬液收集至离心管中于1000RPM下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml培养液后重悬，再按1:2比例分装至新的T25瓶中，添加6-8ml配制的新完全培养基以维持细胞的生长活力。后续的传代可根据实际情况进行1:2至1:5的比例操作。

### 细胞冻存与复苏

环亚集团·AG88推荐的细胞冻存步骤如下：

1. 当细胞覆盖培养瓶80%面积时，丢弃T25培养瓶中的培养液，并用PBS清洗细胞一次。
2. 加入约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞变圆后加入5ml完全培养液以终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，最后将悬液转移至15ml离心管，1000RPM离心5分钟。
3. 弃上清，沉淀细胞后加入1ml的无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱中，如需转入液氮罐，需在-80℃冰箱保存超过24小时。

细胞复苏的步骤为：

1. 将冷冻管迅速从液氮中取出（注意佩戴防护面具），放入37℃水浴中解冻，直至无结晶，随后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将管中细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管，1000RPM离心5分钟。
3. 弃上清，用5ml完全培养基重悬细胞，接种入T25培养瓶，放于37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。
4. 第二天更换为新鲜的完全培养基进行继续培养。

### 注意事项

在运输过程中，有些细胞可能会因不牢固而脱落，这属于正常现象。如细胞脱落严重，可将培养瓶中的培养液收集至离心管，1000RPM离心5分钟，弃去上清作为过渡培养液，残余细胞沉淀后加入1-2ml胰酶进行消化，轻轻吹打后重悬，再在1-2分钟后加入5ml完全培养基终止反应。最后离心后重悬并按1:2比例进行分瓶传代，补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，然后放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

### 问题处理须知

在细胞运输及培养过程中，有可能出现问题，需按以下判定标准考虑是否重发：

1. 若细胞在运输途中出现丢失、瓶身破损或培养液漏液等情况，可申请重发。
2. 如收到细胞后48小时内发现污染问题，请及时告知并提供实验结果，经验证后可重发。
3. 常温运输的细胞在静置24小时后或干冰运输的细胞复苏后24小时内，如大多数细胞未存活（需提供真实清晰的细胞状态照片），可申请重发。
4. 若干冰运输的细胞复苏后24小时内未存活或常温运输的细胞在静置4小时后未开封且出现污染，亦可重发。
5. 收货后的7天内如发现细胞活性问题，请提供真实实验结果，以台盼蓝染色法鉴定细胞活力，经验证后将考虑重发。
6. 收到细胞当日及第2、3天请务必拍照，如3天内未反馈，则视为产品合格；在4-7天内出现问题，需提供前3天的照片以及操作步骤，并与技术人员沟通，若由我方责任引起，将予以重发。若技术人员判定为双方责任，需协商处理或按合同价的50%收费重发。

### 不予重发的情况

1. 客户造成细胞污染，不予重发。
2. 因客户不当操作导致细胞状况不佳，不予重发。
3. 使用非本库推荐的细胞培养体系导致细胞状态不良，不予重发。
4. 若细胞状态不佳且未提供培养前3天的照片，亦不予重发。
5. 细胞在培养过程中经其他处理，不予重发。
6. 如细胞收到后2天内未反馈，不予重发。
7. 其他情况将视具体情况而定。

选择环亚集团·AG88来确保您在细胞培养过程中的每一步都是成功且高效的。